橘子更新速度慢:琼脂糖甲醛变性凝胶电泳

5月25日 09:54 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62 ~ 65 °C）可以在65 °C时熔化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
简单介绍一个关于琼脂糖凝胶电泳的实验
CK同工酶的测定
标本采集、处理和贮存
CK同工酶检测血清和血浆均可。在4℃可保存数天，-15℃可保存2周，若用血浆宜用EGTA，而不用EDTA抗凝。冷冻血浆测定时，应在30℃以下融化，需反复冰融者应加还原剂——巯基乙醇以稳定酶活性，速冻及贮存于-20℃或-70℃，在有β-巯基乙醇和EGTA存在时，MM和MB可稳定数年，而BB则仅稳定半年。由于CK同工酶半衰期短，故酶活性的高低受标本采集时间的影响较大。
琼脂糖凝胶电泳法
1.原理
CK分子是由M和B两种亚单位组成的二聚体，在电泳条件下，CK-BB迁移最快，CK-MB居中，CK-MM最慢。电泳后进行酶促反应显色，观察结果。显色原理是：CK催化磷酸肌酸(CrP)及ADP，产生肌酸(Cr)及ATP，在偶联的HK催化下葡萄糖被ATP磷酸化，形成G-6-P；在偶联的G-6-PD催化下G-6-P被NADP+氧化，形成6-P-G，同时NADP+还原为NADPH。在365nm观察NADPH的荧光或用荧光光密度计扫描定量。也可用四氮唑盐显色法，即利用酚嗪二甲酯硫酸盐(PMS)将NADPH的氢传递给氯化碘代硝基四唑(INT)，使其还原成紫红色的甲鐟，显示CK同工酶区带。
2.试剂
① 50mmol／L Tris-巴比妥缓冲液(pH8.0)：称取巴比妥6.716g，Tris 1.905g，溶于蒸馏水中并稀释到1L，电泳用。
② 30mmol／L Tris-巴比妥缓冲液(pH8.6)：称取巴比妥1.21g，Tris 1.15g，以蒸馏水溶解并稀释到500mL。
③ 5g／L琼脂糖[内含14g／L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]：称取0．5g琼脂糖，1.4gPVP，加试剂“②”100mL隔水煮沸溶解，分装后4℃保存。
④ 400mmol／L Bis-Tris缓冲液(内含20mmol／L醋酸镁、4mmol／L EDTA)，pH7.0：称取Bis-Tris 8.36g，EDTA Na2•2H2O 0.149g，加蒸馏水95ml溶解，用lmol／L醋酸调至pH7.0后，称取醋酸镁(含4分子水)0.429g，加入，用蒸馏水稀释到100mL。4'C保存可用2个月，-20℃保存可用6个月。
⑤ 辅酶溶液(ADP 4mmol／L，AMP10mmol／L，NADP+4mmol／L，葡萄糖40mmol／L)：称取ADP 17.1mg，AMP36.5mg，NADP+29.7mg，葡萄糖72.1mg，加试剂“④”9mL平衡至25℃后，用lmol／L醋酸调pH至6.4(约用lml)，在4℃保存可用半个月。
⑥ 底物显色液甲(按两张载玻片计)：用前于甲管中加试剂“⑤”1.5mL，己糖激酶10.5 U，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6 U。混合后置37℃水浴5min，加入PMS 0.02mg(2g／LPMS 0.01m1)。PMS须避光。在加PMS前的5min内配好底物显色液乙，加PMS后，立即与乙液混合并覆盖于电泳凝胶板上。
⑦ 底物显色液乙：先配制下列试剂；
A. 450mmol几磷酸肌酸：存4℃可用3个月。
B. 5g／L氯化碘代硝基四唑：置棕色瓶贮存，4℃可用3个月。
C. 12.5g／L琼脂糖(含62.5mmol／L氯化钠及35g／L聚乙烯吡咯烷酮)：称取1.25g琼脂糖，加入100mL蒸馏水，隔水煮沸溶解后，再加入氯化钠262.5mg及聚乙烯毗咯烷酮3.5g，溶解后分装，置4℃保存。
用前于乙管中加入“A”液0.2mL,“B”0.2mL，置37℃水浴2min后，加入N-乙酰半胱氨酸(NAC)20mg，或还原型谷胱甘肽10mg。用预温至37℃的滴管吸人，隔水煮沸融化后，温度降至37～43℃(在37～43℃的水浴箱中平衡)的“C”液1.2mL，滴管吹吸混合，使NAC溶解。
⑧ 混合底物显色液：当乙液配成后，立即吸甲液入乙液中，混合后立即使用。在水浴箱中操作，防止琼脂糖凝固。必要时用0.2mL蒸馏水代磷酸肌酸溶液制备对照显色液。如作荧光法，用不含PMS及INT的甲、乙液，用蒸馏水代INT溶液。
3.操作
(1)隔水煮沸溶解试剂“③”，取1.5mL铺于1～1.2mm厚的载玻片上。于近阴极端并行挖两个槽，作两份标本，或作标本与控制物。
(2)加样5μL，80V电泳50min。
(3)合理安排配制混合底物显色液的时间，使配制完成时电泳结束。
(4)将电泳凝胶板置涂以黑漆的铝盒中，吸底物显色液1.5mL铺于凝胶板上，加盖，待凝后置37 ℃水浴1小时。
(5)置固定液(乙醇：醋酸：水＝150:10:40)中2～4小时，转入蒸馏水中数小时，取出观察结果或用光密度计在500nm波长下扫描定量。需要时可平推至空白卡片纸上，37℃孵箱过夜，干片保存。或用无PMS、INT底物显色液，37℃水箱孵育20min。
(6)再置60℃干燥箱中20min,在紫外灯(365nm)下观察荧光。有条件者用荧光光密度计扫描定量，激发波长360nm，发射波长460nm。
4.结果观察
琼脂糖凝胶电泳法的结果观察如图9-14所示。
5.注意事项
广泛存在于各种组织的腺苷酸激酶(AK)催化ADP产生ATP，干扰同工酶结果的判断。加入AMP可抑制此反应，但过量AMP也抑制CK。NaF抑制AK，不抑制CK，与AMP合用可抑制各种AK同工酶的97％。NaF与CK激活剂Mg2+可逐渐形成MgF2沉淀，所以，NaF与Mg2+分开配制，临时混合，不影响各自的作用。电泳需较高pH，酶反应需较低pH，本法中用低离子强度，pH低于8.6的电泳缓冲液；高离子强度，pH低于6.7的基质缓冲液。当含琼脂糖的基质显色剂覆盖于电泳后的凝胶板，上下凝胶中的成分相互扩散后的pH，恰为酶作用的最适pH。Bis-Tris全名为Bis(2-羟乙基)亚氨基-Tris(羟甲基)甲烷，25℃时pKa＝6.46，是CK同工酶。测定优选的缓冲剂，200mmol/L时，CK活力最大。如无Bis-Tris；亦可用咪唑加EDTA作基质缓冲液。EDTA作Ca2+的络合剂，因Ca2+抑制CK活力。血清CK活力随温度升高而增加，直至45℃；更高温度迅速下降，56℃时很快失活。琼脂糖电泳法测CK同工酶，绝不能象作LDH同工酶用温度较高的琼脂糖基质显色液，否则CK活力丧失。而非脱氢酶反应(Nothingdehydogenase，NDH)显著。NDH是相当于白蛋白及β球蛋白区带处的紫红色区带，与蛋白质的巯基有关，标本用量大，pH高时尤其明显，仅四唑盐及PMS就可与标本产生，用测NADPH荧光法可避免。本法中标本用量少，显色时pH较低，NDH反应不明显。CK是巯基酶，绝对需要巯基试剂活化。但巯基试剂可还原四唑盐，N-乙酰半胱氨酸及谷胱甘肽还原四唑盐能力弱，可使背景清晰。PVP是隋性聚合体，作为酶扩散的障碍物加入，可改善区带分离效果。CK不稳定，对光、热及高pH敏感，最好将及时分出的血清充C02后塞紧管口，置冰室或-30℃保存，至少可稳定半个月，及时测定更好。不主张加巯基活化剂保存。影响CK同工酶电泳与显色的因素很多，必须同时作控制物。

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该回答在5月25日 09:58由回答者修改过

参考文献：仪器信息网，http://www.xbmu.edu.cn/k

太专业了,不懂!

缓冲液用TAE就可以。胶的成分不同，其他和非变性胶没什么区别的