电池工厂:中药中溴氰菊脂残留检测方法？

疫分析方法的发展历史
免疫分析（Immunoassay,IA）方法最初是应用于医学领域中，而农药IA是最早也是应用于农药中毒的诊断中，为了诊断农药中毒病人是否需要接受进一步的治疗而测定其血液或尿液中毒物的剂量。关于农药免疫方面早期的报道仅是一些探索性的研究。1967年，Centeno等报道了马拉硫磷抗体的产生，但他们仅仅是观察到抗原-抗体凝集反应的出现，未做应用方面的研究[1]。1968年，Hass和Genteno制备出DDT衍生物DDA的抗体，但不与DDT发生反应，因而未何等进一步研究[2]。1970年Centeno等做了相同的工作并得到相似的结果[3]1974年，Stem-berger等用对硫磷氧化物类似物——血蓝蛋白复合物制备出其抗体，并报道了用放射免疫分析（Radioim-munoassay,RIA）测定抗体水平，但仍未有用IA测定农药的报道[4]。1975年，IAngone等建立了狄氏剂和艾氏剂的竞争性RIA，检测限分别为50pg/mL和2ng/mL[5]。这是IA在农药领域中的首次应用。Levitt于1977年用RIA测定了百草枯中毒病人血液样品中的百草枯含量，检测限为0.6μg/L，与气相色谱（GC）的测定结果相关性为0.998[6]。同年，Lukens等报道了第一个氨基甲酸酯类农药苯菌灵的荧光免疫测定，检测限为ng/mL以下[7]。1978年，Wing等提出了建立了菊酯类杀虫剂丙烯菊酯抗血清的制备并于次年建立了测定其活性异构体的RIA[8]。Cook等在1979年也提出了杀鼠剂杀鼠灵的RIA，检测线性范围为25-1600pg/0.7mL，变异系数（CV）为0.3-9%[9]。

开始建立的农药IA采用的技术多是RIA，由于其需要使用特定的设备及存在放射性防护和污染等问题RIA的应用受到较大限制并逐渐为随后发展起来的酶免疫分析（Enzyme Immunoassay，EIA）所替代。目前，EIA在农药领域中的应用最为广泛。1982年，Hunter等建立了对硫磷氧化物类似物的EIA，测定值为血清中为280pg/mL，缓冲液中为28pg/mL[10]。同年，Wie等提出了测定昆虫生长调节剂除虫脲和BAY SIR 8514的酶联免疫分析（Enxyme-linked immunosorbent Assay,ELISA），最好的检测限可达1ppb[11,12]。这是EIA在农药测定中的最早应用。随后，各种农药的RIA和EIA方法相继被提出和得到进一步改进。

另外值得一提的是单克隆抗体有农药IA中的应用。1983年，血清中百草枯的EIA被Niewola等报道，检测浓度为0.3-10ng/mL[13]，1985年他们通过采用鼠单克隆抗体对这种方法进行了改进，检测浓度为0.8-50ng/mL[11]。这是单克隆抗体在农药IA中首次被采用，因为单克隆抗体的采用不仅提高了抗体的特异性，而且能大批量生产，在生产商品试剂盒上很有价值。随后这种技术得到了推广。

进入了90年代以后，IA技术在农药领域中的应用有了突破性的进展。目前已建立了80多种农药的IA方法。近年来，应用于农药领域的IA不但在方法上不断得到改进，出现了流动注射免疫分析多组分分析物免疫分析、免疫传感技术及免疫分析与其它技术的联用等新技术新方法，而且在管理上趋于规范化、统一化，有专门的评定机构和程序。此外其在农药领域中的应用也不仅限于农药残留分析，而是逐渐深入到农药科学的各个领域。

II． 农药IA的研究现状

1、 应用IA分析的农药

自第一个农药IA的建立开始，迄今已有80多种农药进行过IA分析，不仅有传统的化学农药，还有现在推行的生物农药。不仅包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂、杀鼠剂，还包括动植物生长调节剂，涉及到各个品种的农药[15，17]。其中有机磷农药及其代谢物有：对硫磷（parathion），对氧磷（paraoxon），马拉硫磷（malathion），苯胺磷（fenamiphos），杀螟硫磷（feni-trothion），毒死蜱（chlorpyrifos-methyl,CMP），虫螨磷（pirimiphos-methyl）等。有机氯类农药有：艾氏剂（aldrin），狄氏剂（dieldrin），硫丹（endosulfan），dioxin,DDT,2,4-滴，甲草胺（alachlor），氯丹（chlordane），林丹（lindane），吡草胺（metazachlor），毒莠定（picloram），广灭灵（ clomaxone），达草灭（norflurazone），氟乐灵（trifluralin），乙基丙草胺（metolachlor），二氯烯丹（bu-tachlor），呋喃丹（amidochlor），除草定（bromacil），2，4-滴丙酸（dichlorprop），tetraconazole,pencomazole等。氨基甲酸酯类农药有：甲萘威（carbaryl），苯菌灵（beno-myl），克百威（ canbofuran），禾草特（molinate），噻菌灵（thiabendazole,TBZ），多菌灵（carbendazin），涕灭威（aldicarb）等。拟除虫菊酯类农药有：氯菊酯（perme-thrin），苄呋菊酯（bioresmethrin），1（R）-苯醚菊酯[1（R）-phenothrin]，丙烯除虫菊酯（S-bioallethrin），al-lethrin，氯氰菊酯（cymermethrin）溴氰菊酯等。三嗪类农药有：莠去津（atrazine），扑灭津（propazine），氰草津（cyanazine），特丁净（terbutryn），莠去津代谢物脱乙基莠去津，脱异丙基莠去津，羟基莠去津和羟基菌素（avermectin），依维菌素（ivermectin），鱼藤酮（retenone），烟碱（nicotine），多杀菌素（spinosad），尼鱼丁（ryanodine）等。其它类农药有：植物生长调节剂抑芽丹（maleic hydrazide,MH），昆虫生长调节剂除虫脲（diflubenzuron），BAY SIR8514和烯虫酯（metho-prene），杀鼠剂杀它仗（flocoumafen），杀鼠灵（metho-parin），氟乙酰胺（fluoroacetamide），氟乙酸（fluoroac-etate），还有百草枯（paraquat），敌草快（diquat），灭草松（bentazon），灭草喹（imazaquin），禾草灵（diclofop-metalaxyl）等除草剂和粉锈啉（fenpropimorph），甲霜灵（metalaxyl），粉锈宁（triadimefon），克菌丹（captan）及其代谢物tetraphydrophthalimide(THPI)等杀菌剂。

由于农药IA有其自身的优点，如成本低，简便易行，灵敏率与常规仪器分析一致，且适合现场筛选，因而作为农药分析的一种辅助方法，已经得到并将继续得到充分发展，并且将在农药领域中发挥更大的作用。可以预计，将有更多品种的农药IA方法被建立和进一步完善。

2、 农药IA的主要方法

传统的IA包括放射免疫分析（RIA），酶免疫分析（EIA），荧光免疫分析（FIA）三大技术。这三种技术有农药IA中也充当着重要的角色，特别是EIA，由于另两种技术在仪器设备要求上的局限性，使得EIA成为农药IA中应用最广泛的一种技术。为了提高IA的灵敏性、快速性、选择性和自动化程度，除了采用单克隆抗体以外，又出现了各种免疫传感技术[18]、流动注射免疫分析[19]、多组分分析物免疫分析[20]及免疫分析与色谱的联用等农药免疫分析的新手段，其中免疫传感技术又包括压电免疫传感器、电化学免疫传感器和表面等离子体共振免疫传感器等。关于这方面已有了不少综述[15，17，21]。最近，王方强等综合了荧光免分析、光纤传感器、流动技术、免疫磁球分离四项先进技术，又建立起一种新型荧光光纤免疫磁珠流动分析系统，该系统具有通用性，但尚未商品化[22，23]。当然这些新技术也有其各自的优缺点，要根据实际情况选择使用，才能达到好的效果。

农药免疫分析试剂盒的应用使得农药IA更趋于标准化和规范化。1990年，由于IA作为检测方法的合法性尚未完全被正式确定，只有10余种农药免疫分析的商品试剂盒，随着免疫学检测方法的逐渐被采纳，目前又有多种农药的免疫试剂盒被允许使用。这些试剂盒不仅用于水样、食品残留及环境检测，也逐渐用于生物检测。今后随着分子生物学、基因工程及电脑技术的发展，可望合成更高亲和力的特异性的抗体并使操作自动化，从而推动免疫分析技术的更大进步。

3、 农药IA的应用

最早的农药IA是用于医学上测定中毒病人血清中农药的含量，以诊断病人是否需要接受进一步治疗。之后随着IA技术的发展和人们对环境及自身健康的关注，农药IA被应用于残留分析中，最初是检测水样和土壤样品，之后发展到粮食、蔬菜、水果、饮料、食品、药材及动物的血液、尿液和组织等生物样品的检测，农药残留分析是农药IA应用最广阔的市场。农药IA在环境、食品、中药残留分析方法的应用也已有一步发展，农药IA也被应用于农药毒理学中药物的作用机理[24，27]、药物定位[28，29]及其代谢研究，IA与色谱技术的结合也为样品的分离富集提供了有效的手段[30，31]。

III． 农药IA存在的问题及对策

1、 免疫原的制备

制备出足量、符合要求的抗体是农药IA分析中一个必要条件。因为大部分农药都是小分子化合物，本身没有免疫原性，直接注入动物体内不能诱导抗体的产生，所以必须与大分子载体偶联形成免疫原后，再免疫动物才能制出相应的抗体。因此农药免疫原的合成就成为农药IA的前提，能否合成稳定，具有良好免疫原性的农药——载体结合物是整个农药IA的关键。制备农药免疫原的方法有碳二亚胺法、混合酸酐法、戊二醛法、琥珀酸苷法和重氮化法等。制备农药免疫原的反应条件不能导致半抗原子结构发生明显的改变，否则抗原性将发生改变。制备好的半抗原结合物在动物被免疫前，需要测定结合物中半抗原数目，因为结合物半抗原分子数目太多或太少，诱发抗体的能力都很差。关于免疫原的制备虽然已做了大量工作，有不少经验可以借鉴，但对一个新的、具体的农药分子，其免疫原的合成要从实际出发，具体问题具体对待，最好设计多套方案进行优化选择。这是建立小分子IA分析方法中最重要的一步。

2、 溶剂的选择

这主要是对脂溶性农药而言的。因为抗体是一种蛋白质，最适宜在水溶性介质中起作用，因而IA的反应休系都是水溶性介质。对于在水溶性介质中的不溶或溶解性差的脂溶性农药，溶剂的选择是影响农药IA的重要因素之一，它们不溶于IA所用的水溶液缓冲液，不同浓度的非水溶剂对IA的影响至今还没有系统研究。但有人提出，IA体系中有机溶剂的量小于5%时，对测定结果没有显著影响。关于这方面的工作，已做了不少探索性的研究，涉及的有机溶剂有已烷、环氧已烷、乙腈、丙醇、正丁醇、1-戊醇、丙二醇、甲醇、二甲亚砜等，研究结果也各不相同，至今未有系统性的结论。作者认为这个问题也应具体问题具体对待，应以检测结果的准确性和可行性为依据。

3、 交叉反应问题

在农药IA中的抗农药抗体对于结构非相关的靶抗原（农药）表现极高的特异性，但某些与检测农药结构相关的农药或待测农药的代谢物可能与抗待检农药抗体发生不同程度的交叉反应。如果样品中存在这些物质，该农药的定量检测就会降低为半定量或定性检测，而且可能会出现假阳性结果，影响方法的准确性和可靠性。对于农药IA的交叉反应，最根本的解决办法是制备高特异性和高亲和力的抗体，采用单克隆抗体或应用分子生物学、基因工程及电脑技术合成更高特异性和高亲和力的抗体可望解决这个问题。但从另一个角度看，这种交叉反应又是特别有用的，利用这种交叉反应可用抗一种农药的抗体对包括母农药在内的结构密切相关的类似物及代谢产物进行多残留检测。利用交叉反应也可用于发现或检测以前不为人类所知的代谢或其它未被检测到的母体化合物。一个例子是检测除草剂甲草胺时，作为地表水和地下水主要污染物甲草胺ESA（alachlor ethane sulfonic）的发现，另一个例子是检测西德克萨斯水样中的莠去津时发现了扑草净和扑灭津[32]。另有研究者认为，可以把抗几种结构相关或非相关的农药抗体混合，利用这种混合抗体进行几种农药多残留分析，对检测大批量且农药污染又没有规律的样品，可以节省大量的时间和工作量。

IV． 结语
虽然农药IA在某些方面还存在一定的局限性，但由于农药IA自身的优点和其本身在方法上的不断改进，它在农药领域中发挥着重要作用。并且这种新颖技术不再停留在研究阶段，其中有些技术已商品化，这为其应用创造了条件，并使之可能成为常规分析方法，虽然这仍需要做许多工作。从已建立的农药IA法与GC、HPLC等常规仪器分析的结果比较来看，相关系数多在0.9以上，且免疫分析价格上要便宜的多。可以预见，它在农药领域中将发挥愈来愈大的作用。