反正弦函数的定义域:GR靶基因

作为配体依赖性转录因子家族成员之一的糖皮质激素受体(GR),通常以激素游离型和激素结合型两种状态自由穿梭于细胞质和细胞核之间,这种核质间运动的平衡状态决定着胞质与胞核任何一方中GR是否处于主导地位,从而影响细胞的多种生理功能.GR转移和作用的发挥有赖于胞浆中多种辅助蛋白,即受体附件蛋白的参与,主要有免疫亲合蛋白(FKBP51,FKBP52),共分子伴侣BAG-1及热休克蛋白(HSPs)等.而受体蛋白介导的信号传导与平衡调节的维持主要由受体附件蛋白来完成.本文主要对受体附件蛋白的效能和与GR的相互作用的新模型及与之相关的疾病和治疗予以介绍.
受体附件蛋白(RAPs)与GR的相互作用
1.1免疫亲合蛋白(immunophilin) 免疫亲和蛋白因与免疫抑制剂FK506和环孢素A高亲和力结合而命名.大分子量免疫亲和蛋白分子FK506结合蛋白-51,-52(FKBP51,FKBP52)及环孢素A(CSA)结合环蛋白-40(Cyp40)具有序列同源性和组织结构相似性.其NH2末端基序具有肽基脯氨酰基异构酶(PPIases)活性,能够使靶蛋白脯氨酰肽键从顺构体变成逆构体.其COOH末端基序包含3个三十四肽重复序列,能够在蛋白-蛋白反应时使34个重复氨基酸降解.大分子量免疫亲和蛋白具有与许多不同的分子发生相互反应的功能,通过与磷酸酶PP5竞争结合GR复合物中HSP90的TPR接受位点来调节受体活性.
FKBP51和FKBP52是具有不同生化功能的FK506结合大分子量免疫亲和蛋白.在类固醇激素受体复合物的形成过程中发挥着重要作用.FKBP5s作为PPIases主酶家族成员之一,其基因位于6q21.3-21.2,主要参与细胞的三种不同生理过程,即核受体的辅助,钙释放通道的开放和受体蛋白激酶的激活.其形成核受体异源复合物的多区间肽基脯氨酰基顺反异构酶活性广泛存在,并且与HSP90一同使受体蛋白处于功能折叠状态.在哺乳动物中FKBP51和FKBP52对GR的调节是主要通过两个不同的水平:激素结合和核转移来进行的.
1.1.1 FKBP51 微分显示和基因分析发现FKBP51是一孕酮可诱导基因分子,命名为FKBP54,p54或FF1Ag.与灵长类相比,其氨基酸的94%,PPIases区间的92%和三十四肽重复域(TPR)的99%相同[1].和人FKBP52一样,其结构含2个FKBP区和3个TPR基序.
在灵长类动物受孕酮刺激而表达增加的FKBP51可以削弱孕酮的反应性,明显降低GC对GR的结合及GR的活性.尽管过度表达的FKBP51可能是使孕酮受体(PR)复合物结合力降低并且是诱发孕酮抵抗的原因之一,而且免疫抑制剂FK506和雷帕霉素(rapamycin,RPM,昔罗莫同sirolimus)通过作用于FKBP51来诱导改变GC与GR的结合参与GC抵抗,但FKBP51依然是游离型高亲合力GR复合物的常规成员之一.GR信号的传导受到与FKBP51对PR相同方式的调节,而且猴体FKBP51的过度表达是引起孕酮抵抗的诱发因素之一[1],然而,这是否意味着一种对于其它类固醇激素的抵抗都适用的通用机制的存在值得探讨.
最初认为FK506能够在酵母中加强PR介导的转录,但过度表达的FKBP51并不影响GR作用的发挥 [2],后来证实这种加强效果是对FK506敏感性类固醇外流机制抑制的结果.FK506能够抑制孕酮和GC诱导的T-47D细胞转录及醛固酮介导的RC.SV3肾小管细胞的转录[3],说明FK506效能的发挥并不是特异地针对一种受体类型.近期研究发现:①孕酮对FKBP51的诱导不依赖于蛋白的合成,但可以被孕酮受体(PR)拮抗剂RU486所阻断;②人FKBP51启动子报告基因结构包含的约0.4kb的上游序列显示出孕酮反应性;③用人FKBP51 cDNA表达的质粒转导HepG2细胞能够使孕酮剂量反应曲线右移 [4];④ FKBP51 mRNA分别受到GC,孕酮和雄激素的诱导;⑤多个基因的PR依赖性诱导可能是通过与启动子相近的Sp1位点的相互反应有关[5],这些都表明FKBP51在基因转录水平受到类固醇的诱导并参与对类固醇受体活性的调节.电泳分析显示孕酮受体结合于激素反应元件(HRE)的内显子E1,而PR和GR两者共同和HRE的内显子E2反应,这说明GC和孕酮对FKBP51的转录调节有赖于内显子远端序列[6].突变实验表明FKBP51基因的改变会阻断与HSP90的结合而同时其抑制效果消失,这种效能可能是通过与PR复合物的HSP90相互反应而被介导.因此,通过对PR介导的FKBP51的诱导,表达增加的孕酮参与调节FKBP51对孕酮的后续反应,进而建立一个短的负反馈环,通过此环GC的敏感性及活性受到一定的影响.值得注意的是,FKBP51内在的PPIases活性对GR功能并不起作用,而很有可能有赖于位于TPR区内的氨基酸序列[1].
1.1.2 FKBP52 FKBP52是一个表达广泛的FK506结合免疫亲合蛋白,也叫HSP56,p52,FKBP59或HBI, 具有PPIases活性和参与蛋白-蛋白反应的三十四肽重复序列.FKBP52在类固醇受体功能发挥上具有重要作用,同时参与多种其它生理过程,包括对生长和发育的调节,转录调节,阳离子通道(果蝇TRPL钙通道)活性调控[7],基因转换效率的调节,神经保护和调节心肌营养素-1(CT-1)的心肌营养作用等.
FKBP52通过其PPIases特性调节GR的受体结合能力和加强GR依赖的转录活性,但是,PPIases缺陷的FKBP52仍然能和动力蛋白反应,却强烈地抑制GR依赖的转录.另外,FKBP52对GR信号的有效调节还依赖于其和HSP90的反应及和动力蛋白的结合:一方面酪蛋白激酶II磷酸化的Thr143位于2个 FKBP同源区的绞链部分,控制着FKBP52对HSP90的结合特性.FKBP52通过与其它TPR蛋白竞争性结合于TPR区使其与HSP90相互作用而附属于GR异源复合物;另一方面FKBP52与GC活化受体移动密切相关,经由与PPIases区的结合来调节信号传导[8],而且通过与微管动力蛋白(Dynein)反应使GR顺细胞骨架向核内转移.
1.2 共分子伴侣BAG-1 作为核受体蛋白伴侣分子的BAG-1,在与视黄酸受体(RAR)作用引起对RAR结合DNA 反应元件与RAR依赖性转录的抑制调节的同时,GR的转录活性也受到明显影响.最初由于BAG-1和抗凋亡因子Bcl-2相关而得以确认,现在发现BAG-1具有参与调节细胞凋亡,肿瘤发生,神经元分化及与包括GR在内的许多胞内调节蛋白反应等的多种重要生理及病理过程.BAG-1通过结合于GR绞链区而抑制GR对DNA的结合以及GR的受体转录活性,从而发挥GR负性调控因子的作用,也叫GR相关蛋白46(RAP46) [9].而且BAG-1通过与HSP70相互作用对GR发挥分子伴侣调节因子的作用,故也称作HSP70或HSC70相关蛋白(HAP46)[10].
BAG-1与HSP70反应蛋白(HIP)的刺激活性相竞争,而HIP反过来对BAG-1的GR结合GC负性调节作用产生拮抗[11].BAG-1对GR依赖性转录的抑制与其HSP70反应区相关, BAG-1与HSP70的结合点和与DNA的结合点共处于一个分子上.BAG-1不仅影响GR的折叠和相关转录活性,而且直接以非特异性方式结合于DNA并激活非GR依赖靶基因的转录,此活性可以通过对其N末端10个氨基酸的去除而消失.另外,BAG-1依赖其C末端的HSP70结合区可以转移入胞核后再与GC或GR结合起作用.最近研究显示,BAG-1对GR依赖性转录的抑制作用是通过其C末端首部8个氨基酸实现的,而不是富丝-苏氨酸E2X4区;而BAG-1对DNA的直接结合可能是因为N末端正电荷与DNA磷酸骨架负电荷的相互作用有关[12].
1.3 热休克蛋白(HSPs) HSPs是一个广泛存在于生物细胞内的蛋白质超家族,包括HSP110,-90,-70,-60,-40,-27及-10等,参与细胞的多种生理及病理过程,不仅在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象,保护细胞生命活动,而且具有促进蛋白质分子折叠,跨膜转运,移位及细胞骨架稳定等基本生理功能,同时参与免疫调节,细胞凋亡,热耐受,抗病毒感染及抗肿瘤等.其中,多个HSPs成员由于能够结合并稳定其它蛋白质多肽,减少胞内蛋白质错误折叠和聚集,控制激活/非激活状态开关,并且不构成被介导蛋白质的组成成分而被列为分子伴侣.对GR功能发挥起主要作用的HSPs是HSP 70和HSP90分子.
HSP70直接参与并促进细胞内蛋白质从初生链的合成到多亚基复合体折叠,装配的整个生物过程.在细胞内,HSP70 一方面可以识别错装和变性的蛋白,并结合成一种复合体,使肽链中错配的部分得以纠正或直接通过蛋白分解作用降解它们;另一方面HSP70 也可以对抗细胞内正常蛋白的降解.HSP70 通过蛋白拆叠作用参与蛋白质向内质网的易位,以利于维持酶的动力学特征,维护细胞功能,业已清楚,HSP70 的分子伴侣作用依赖于细胞内ATP 的循环反应,ATP-ADP 的相互转换反应同HSP70与多肽的结合与解离的过程相偶联. HSP70对GR辅助作用的发挥受到多个分子如BAG-1,HSP40,HSP70反应蛋白(HIP)及HIP C末端等的调节:来源于同一基因不同翻译起始位点的 BAG-1均可抑制HSP70依赖的蛋白质再折叠活性;HSP40能够加强体外HSP70 ATP酶的活性及HSP70依赖的再折叠,从而稳定GR;与HIP的 HSP70分子伴侣活性正调控因子特性不同的是,HIP C末端发挥对HSP70 ATP酶活性的抑制作用并干扰HSP70底物复合物的稳定性[13].
HSP90蛋白表达的改变或基因型的突变与GC反应性的下降和GR效能的降低密切相关.HSP90和FKBP52的PPIases区与受体蛋白GR作用保持其处于功能折叠状态,从而对GR功能的发挥产生重要调控.格尔德霉素(geldanamycin)及其低毒性衍生物17-AAG作为HSP90 分子伴侣作用的抑制物,通过与ATP/ADP竞争性结合于HSP90,可引起包括类固醇激素受体在内的多种信号蛋白的降解[14],这对HSP90通过GR参与细胞功能调节机制的进一步认识具有重要意义.
1.4 受体附件蛋白与GR活化新模型 GR由800aa组成单链磷蛋白,蛋白质结构主要包括几个独立的功能区:①DNA结合区(DBD),由80aa残基构成,其中心部分为两个能与DNA双螺旋的大沟结合的锌指结构,负责与靶基因启动子或增强子上的GC反应元件(GRE)结合;②COOH末端的激素结合区(HBD),除了结合激素配体外,还参与形成GR二聚体及结合HSPs;③NH2末端的免疫原区(ID),具有特异性抗原活性,含有多个可磷酸化的丝-苏氨酸E2X4位点,参与GR对靶基因的反式激活转录;④邻近HBD的Taul区,主要参与GR的核内转位.
无配基存在时,GR存在于胞浆中与多种伴侣分子形成的300KDa的蛋白复合物结合处于激素竞争状态.此过程的中心环节是HSP90,HSP70,HSP70/HSP90组合蛋白(HOP)及HIP,HSP90结合于GR的COOH末端,参与GR的折叠构型并防止其自胞浆向核内转位,四者随同HSP40一起与GR形成初始复合物;随之HSP70,HIP和HOP可能脱离使p23和FKBP51进入,形成ATP依赖的终末复合物,使GR获得GC结合竞争力;具有结合GC竞争力的终末复合物在募集动力蛋白的同时,与进入胞质的配基GC结合,发生FKBP52与FKBP51的互相交换,由FKBP52取代FKBP51,最终以GR活化复合物2HSP90/P23/HSP40/FKBP52/Dynein/GR/GC形式移入核内,入核后甾体受体附件蛋白与GC/GR分离,有活性的GR即可识别糖皮质激素反应元件(GRE)序列,由于GRE位于GC目的基因的启动子区域,故可诱导或阻抑目的基因的表达而发挥效应.
研究发现,HSP70和HSP90不仅在胞浆中发挥作用:HSP70在活化的GR和BAG-1入核过程中起辅助作用[15],HSP90参与亚细胞底物转移和染色质GR的再循环,同时HSP90反应分子p23参与染色质装配和GR活化调节[16].和p23依赖HSP90一样,BAG-1依赖于HSP70在核内发挥着使转录复合物解离的功能[12].此模型GR信号传导过程中,FKBP52与HSP90直接反应,FKBP51与FKBP52之间的互相交换对GR达到活化与复合物转移至关重要.其中FKBP52对GR的核内转移不可或缺,而FKBP51则引导GR出核与HSP90一道参与GR再循环[17].(见附图)
受体附件蛋白及GR相关疾病和治疗
FKBPs,BAG-1和HSPs在GR信号传导中可能与GR功能失调相关的多种疾病关系密切.首先,由于GR的突变或HSP90功能的限制而引起GR作用发挥异常;再者,不论是GR的抑制性共分子伴侣BAG-1还是激动性分子FKBP5都是导致GC抵抗的重要原因[18].何庆南等研究发现激素抵抗型原发性肾病综合症(NS)除了受体内总GR水平的增减影响外;在GR总体不变时,GRα和GRβ两种亚型表达比例失衡,GRβ表达亢进,GRα表达低下可能是导致NS患者GC抵抗更为重要的原因[19].
GR介导的MAPK失活对细胞的存活有利,即使细胞凋亡减弱,肿瘤扩大[20].HSPs通过参与Fas死亡受体途径,caspase途径和JNK/SAPK途径在细胞生长和凋亡过程中发挥重要作用[21].HSP70 通过结合并抑制应激活化蛋白激酶(JNK)的活性,以及与Bcl-2 家族抗凋亡相同的机制抑制细胞的凋亡,主要包括在caspase 活化的上游和下游分别抑制caspase3 和caspase9 的活性及其前体加工而阻断细胞凋亡途径;抗细胞凋亡的多功能蛋白BAG-1为热休克同源蛋白70(HSC70)及HSP70 的ATP-ADP 循环的核苷酸转换因子,通过调节HSP70 的伴侣活性来获得抗凋亡功能.因此,通过对MAPK及各相关传导途径的调节,使GR和HSPs在不同疾病过程中显现不同的调节作用,即抑制或促进ERK和JNK磷酸化,反过来减低或增加ELK磷酸化和许多ELK-1依赖的靶基因的表达,从而达到治疗目的.
GC使白血病细胞FKBP51的基因转录上调.这些基因则位于GC诱导的凋亡蛋白家族Bcl-2的上游.即使在蛋白合成抑制剂放线菌酮存在时,GC也能诱导此基因的表达上调,这说明FKBP5直接引导GR的靶基因.FKBP5内含子2具有GC反应元件,参与GC的反应性.此反应元件由一个完整的(A/T)G(A/T)(A/T)C(A/T)序列和两个被2-4个核苷酸分裂形成的不完整的 (A/T)G(A/T)(A/T)C(A/T) 序列上下包围组成.因此,在白血病和淋巴瘤病人对GC靶基因表达的调控可能会提高治疗的有效性[22].
鉴于免疫细胞在全身炎症反应综合症(SIRS) 发生中的重要作用,HSPs 在单核/巨噬细胞及中性粒细胞中的表达对SIRS 的发生,发展及转归意义尤为重要.HSPs 通过抑制NF-κB 的核转运来和诱导I-κB基因的表达调节促炎介质的表达,因而间接下调促炎细胞因子的表达.此外,用转基因的方法诱导细胞表达HSP70 可以减轻H2O2 介导的蛋白氧化,脂质过氧化,从而起到细胞保护的作用.HSPs 通过抗凋亡,抗炎及分子伴侣作用机制对SIRS病理损害起到保护作用.
FKBP5的多态性与应激状态的易发性和对抗应激治疗的快速反应密切相关,从而与胞质GR功能的适应性变化相联系,这不仅使失调的下丘脑-垂体-肾上腺(H-P-A)轴快速趋于正常,并且导致应激时GC超反应的发生[23].通过对FKBP5的相应调节处理,使GR功能和H-P-A轴更易发挥有利的作用可能在应激性疾病中是一个比较理想的施治措施.FK506预处理可减轻内毒素所致是急性肝损伤,其可能是通过降低血清TNF-α,IL-1β含量,下调炎症反应而发挥抗炎作用[24].
FKBP凋亡序列蛋白转基因老鼠心衰模型研究显示,FKBP凋亡序列蛋白突变老鼠存在心肌的自发性病理死亡,而抑制心肌细胞在心衰时的凋亡,有利于心肌舒缩功能失常的改善.说明FKBP凋亡序列蛋白的活化和心肌凋亡是引起心衰的因果机制之一,通过对此过程的抑制,可能是心衰的一个基础性新型治疗方案[25].雷帕霉素(RPM)是31环组成的三烯大内酯环类化合物,其结构与PK506相像,亲脂性强,RPM通过不同的细胞因子受体阻断信号传导,阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程,从而发挥免疫抑制和抗细胞增殖效应,是比FK506或环孢菌素A(CSA)更有效的免疫抑制剂,毒副作用明显比CSA和FK506小.在体外通过抑制细胞分裂周期激酶和视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化来抑制人和鼠动脉平滑肌细胞的分裂和移动,这有利于防止经皮冠状动脉成形术后冠脉再狭窄及心脏移植术后速发性动脉病的发生.
免疫亲合蛋白的配体FK506是从土壤真菌中提取的一种大环内酯类抗生素,分子式C44H69NO12.H2O,分子量为822.05Da,具有神经营养药物特性.近年来的研究发现, FK506的受体—免疫亲合蛋白在脑内大量存在,尤其在神经损伤时能够急剧上调.体内外研究均显示,FK506及其人工合成的结构拟似物对多种神经元(包括DA能神经元)有促进轴突生长和神经保护作用.因此,针对免疫亲合蛋白构效关系的药物设计已成为治疗帕金森病(PD)药物研究的新热点[26].
他克莫司霜(tacrolimus,FK506)作用的主要靶细胞为T淋巴细胞,通过与特异胞浆蛋白即免疫亲合蛋白(immunophilin)或FK506结合蛋白(FKBP)紧密结合,进而发挥抑制早期淋巴细胞相关基因表达的作用;此外,它还能抑制皮肤肥大细胞IgE介导的释放组胺作用,主要适应于中重度特应性皮炎的治疗[27].
利用组织芯片免疫组化法,检测乳腺癌,直肠癌,癌旁组织及正常组织中BAG-1的表达,结果表明,组织芯片中BAG-1在乳腺癌,直肠癌组织中的表达比其癌旁及正常组织中均高,乳腺癌,直肠癌组织中BAG-1的高表达,提示BAG-1可能参与了乳腺癌,直肠癌细胞凋亡与分化的调控[28].这可能为乳腺癌和直肠癌的诊断与治疗提供了一个比较直接的介入方法.
3. 展望
(1)FKBP5在人和微生物如酵母中起着不同的作用,而GR在酵母中的信号传导是否受到FKBP5结合动力蛋白Dynein的影响需要进一步验证.
(2)FKBP5与GR作用时有多个反应区的参与,而进一步研究需说明FKBP5的其它活性区域在GR相关功能上的精确调节作用.
(3)ATP在GR终末复合物转移过程中至关重要,而p23对转录调节复合物的重要调节是否也是ATP依赖性的依然未明.
(4)新模型中,BAG-1对DNA的结合是否意味着其它重要功能的存在;并且此模型是否也适用于其它核受体值得研究.
(5)受体附件蛋白参与GR功能调节,在多种疾病包括炎性疾病在内,GC抵抗时,其中促炎细胞因子巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是否与受体附件蛋白间存在联系需进一步探讨.
(6)感染性休克时,胞内NO的产生增加,而NO反过来影响GC作用的有效发挥,因此,NO,iNOS,受体附件蛋白,MIF,GR,GC以及其它促/抗炎因子之间是否存在复杂的相互调控关系,需进行大量实验来证明.
(7)GC的分泌受到ACTH的调控,而ACTH作用于GC时需有Ca2+的参与,Ca2+对GC活化GR具有重要作用,因此Ca2+,受体附件蛋白,GR及GC间的相互关系如何需待验证.
(8)免疫亲合蛋白配体之一的FK506 除了有免疫抑制作用外,还有神经营养作用,进一步的研究证实,这两种作用是相互独立的,提示有可能单纯利用FK506 的神经营养活性来促进神经生长而不影响机体的免疫功能.如何利用上述免疫抑制剂的免疫抑制作用和FK506 的神经营养作用,用于临床周围神经损伤修复,抑制神经损伤后自体免疫反应,促进神经修复,再生和功能恢复,具有一定的探讨价值.
(9)HSPs 抗氧化的机制可能与如下作用有关1)使氧化剂血红素蛋白耗竭;2)产生抗氧化剂-胆绿素,胆红素;3)提高细胞内游离铁水平,使铁蛋白表达上调;4)提高细胞cGMP 的基础水平;此需进一步实验验证.
(10)进一步的研究需澄清:1)在SIRS 发展过程中,细胞因子和炎性介质的水平与免疫细胞HSP70 表达的关系以及HSP70 表达能力与水平对预后的影响;2)寻找理想的HSPs诱导药物或完善基因治疗方法,对不同细胞HSPs 表达的干预可能将成为预防和治疗SIRS 及其他急危重病的新措施.