武装突袭可以联机吗:做PCR反应为什么在循环结束后要有5min延伸反应？

做PCR反应为什么在循环结束后要有5min延伸反应
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这个问题比较好理解，因为在循环结束后，体系中的taq酶可能很多正处于复制状态，如果此时降到室温，将会影响最终产率。所以再留出5分钟，以使正在复制中的taq酶能够复制完全，以合成更多的目的分子。

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看来可能我的表述不够清楚，那我稍微详细的说下
我们来看看最后一个循环
先95度，dna在高温下变性，解链成单链分子
然后退火，具体温度与所用引物有关，就以55度为例吧。
引物与单链dna模板结合上去
再72度延伸，在taq聚合酶的作用下，引物延伸。
该循环结束。
注意，此时尚有正处于合成过程中的dna链，为了保证充分的得率，所以再增加5分钟，以允许尚处于合成状态的dna分子能够完成整条链的合成。

在rna的逆转录时，也有这样的一个步骤。
用途也是一样的。

不知这下有没有讲清楚？

楼主指的延伸反应是退火后的，还是整体35次左右循环结束后的？
退火后的是让其分子链延伸，最后的我就不确定了，刚翻书翻了半天也没找到，似乎是待体系趋于温和、平静，否则容易伤害到刚合成好的DNA。

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PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

看vagabonder - 同进士出身 七级说的我就不理解了……
vagabonder说：因为在循环结束后，体系中的taq酶可能很多正处于复制状态，如果此时降到室温，将会影响最终产率。所以再留出5分钟，以使正在复制中的taq酶能够复制完全，以合成更多的目的分子。

如果说taq酶此时正处于复制状态，那延伸时间它在干什么？
更重要的是，如果说taq酶此时正处于复制状态，那循环内可是每次延伸时间完了之后就立刻升温到90度以上进行下一轮循环的变性，而90度以上DNA合成几乎是停止的，照vagabonder的说法，岂不是PCR整个过程30-40次循环都没产物，只有最后一次有产物？