神界原罪2 众筹:硝酸还原酶的测定方法

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键性酶，它与作物吸收和利用氮肥有关。NR作用于NO3-使其还原为NO2ˉ：
NO3ˉ+NAD(P)H+H+→NO2ˉ+NAD++H2O
产生的NO2ˉ 可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2-含量的增加，即可表现NR活性的大小。
NO2ˉ含量的测定采用对氨基苯磺酸（sulfanil-amide）比色法。在酸性溶液中对氨基苯磺酸与NO2ˉ 形成重氮化合物，该重氮化合物在进一步与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在pH 7.5时540 nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定其光吸收值，从而间接测得溶液中的NO2ˉ的量。这种方法非常灵敏，能测定每mL含0.5 μg的NaNO2。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以 μg NO2ˉ /( gFW· h )为单位。
一、仪器、药品与材料
　　（一）实验材料
新鲜的植物叶片（如豌豆、王米、小麦、大豆等）。
　　（二）仪器与用品
50mL三角瓶、打孔器（直径 0.5 cm）、真空泵、温箱、分光光度计、移液管 （5mL 3 个、 1 mL 2 个、 2 mL 2 个）、天平 1 台。
　　（三）试剂
1．1%对氨基苯磺酸：称取1.0 g对氨基苯磺酸溶于 100 mL 3 mol/L HCl 中（25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL ，即为 3 mol/L HCl ）。
2．α-萘胺试剂：称取0.2 g α-萘胺，用含1 mL浓盐酸的蒸馏水溶解，再用蒸馏水稀释至100 mL。
3．NaNO2 标准液：称取 0.1 g NaNO2，用蒸馏水溶解后定容至100 mL。吸取其中5 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL。此溶液每毫升含有5 μg NaNO2，用时再根据不同需要稀释。
4．0.2 mol/L KNO3：称取 KNO3 2.002 g，用蒸馏水溶解，移入100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。
5．0.1mol/L磷酸缓冲液，pH 7.5：见附录7。
二、实验步骤
1．将新鲜取回的叶片洗净，用吸水纸吸干，再用钻孔器钻成直径约1 cm的圆片，最后称取等重的叶圆片两份，每份约0.3~0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50 mL三角烧瓶中：（1） 0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.5）5 mL +蒸馏水5 mL（对照组）；（2）0.1 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.5）5 mL +0.2 mol/L KNO3 5 mL（实验组）。将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中。如果没有真空泵，也可以用20 mL注射器代替：将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使其真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中。将三角烧瓶置于30℃温箱中，暗中保温30min后，分别吸取反应溶液1mL，用于测定NO2ˉ含量。
2．NO2ˉ含量测定
将步骤一中吸取的1 mL反应溶液置于一试管中，加入对氨基苯磺酸试剂2 mL及α-萘胺试剂2 mL，混合摇匀，静置30min，立即用分光光度计测定520nm处的吸光度（OD）值。
3．绘制标准曲线
分别吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5 μg/mL）各1 mL于试管中，加入对氨基苯磺酸试剂2 mL及α-萘胺试剂2 mL，混合摇匀，静置30min，立即520nm处的OD值。然后，以OD值为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标绘制OD值-浓度标准曲线，或者根据浓度与OD值关系直接计算回归方程。
4．从标准曲线上查得实验组与对照组反应液中的NaNO2含量，并计算硝酸还原酶活性：
酶活性（μg NaNO2/ g FW· h）=(C2-C1)×V/t×W
式中：
C1——1 号三角瓶里 NaNO 2浓度（μg/mL） 。
C2——2 号三角瓶里NaNO 2浓度（μg/mL）。
V ——反应液总体积（mL） 。
t ——反应时间（h）。
W ——植物鲜重（g）。
　　注意事项：
　　1．硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4℃下进行。
　　2．硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝酸盐还原为氨。
　　3．从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。

硝酸还原酶活性的测定

原理

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮

简单易行，在一般条件下都能做到。

红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。

仪器药品

721型分光光度计 真空泵（或注射器）

保温箱 天平

真空干燥器 钻孔器

三角烧瓶 移液管

烧杯

0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。

0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。

磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。

α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。

操作步骤

1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸

注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加

保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测

3. ．绘制标准曲线

与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。

吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。

实验作业

1．试比较不同植物的酶活性。

2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。

参考文献

1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。

2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。

3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503.

4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336.

5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807

（华东师范大学张志良）